Laser Tribune China No. 1, 2018
700 fs激光曝光过程中牙髓干细胞的光损伤
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激光论坛
LASER TRIBUNE
香港，2018年9月28日出版
会员资料
第18卷第9期
700 fs激光曝光过程中牙髓干细胞的光损伤
[德国] Karsten König & Anton Kasenbacher
材料和方法
细胞
将成人牙髓中提取的人干细胞（由
S.Gronthos，NIH，贝塞达斯，美国提供）
培养在Gibco BRL生命科技公司（苏格兰佩
斯利）的1/8改良的Eagle’s培养基中，加入
20%FCS，2mML-谷氨酰胺，100μML-抗坏
血酸-2-磷酸酯，100μM青霉素和100μg/ ml链
霉素在5％CO 2和37℃下在25ml和75ml细胞
培养物中的溶液（Greiner，Frickenhausen，德
国）。处理细胞进行实验，并在37℃用0.25％
胰 蛋 白 酶 ， 5mM葡 萄 糖 ， 0.05％ EDTA的
PBS溶液培养5分钟。 从培养基底部分离后，
将细胞在细胞室（MiniCeM，JenLab GmbH，
Jena，德国）中进行激光显微镜检查。
之前在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞上进
行过比较研究，这些细胞在许多国际实验室
都作为参考细胞。
将CHO细胞在含有10％FCS，L-谷氨酰
胺和青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素
混合物的Dulbeccos HAM-F12培养基（Gibco
BRL）中并且是5％CO 2和37℃下孵育。胰蛋
白酶化与干细胞相对应。
个别细胞在外部玻璃窗上有特殊的菱形
图1：飞秒激光系统与脉冲拉伸装置。
雕刻。在检测细胞损伤的情况下，利用相衬
技术可以很容易地定位这些雕刻。
中心波长处实现的。在辐照后，细胞被转移到
培养箱中，以保证进一步生长、细胞分裂和修
激光显微镜
复过程的最佳条件。
80 MHz Ti:Sa激光，Mai Tai （0spectral
- physics, Mountain View, USA）在近红外光
脉冲拉伸装置，产生和测量700 fs脉冲
谱（NIR）中应用于飞秒激光显微术。使用
为了将样品的脉冲持续时间提高到
测量仪器Fieldmaster（Coherent，Santa Clara，
700fs，在显微镜前的光路中实现了脉冲链路
USA）和测量头LM2确定显微镜入口和物镜平
单元。该装置由镀膜反射镜和两个平行排列
面（样品的功率）处的激光功率，并且在必
的镀金光栅组成，光栅常数为600行/毫米。第
要时通过灰色滤光片进行变化。所测量的值
二个光栅被安装在一个具有微米精度的机动台
是在提交的协议中被指定的。与空气相比，
面上。脉冲宽度随光栅距离的变化而变化。激
这种校正来自有限的测量区域并且改变了介
光束通过第一个光栅接收到空间色散，在第二
质中的辐射条件。
个光栅处进行补偿（图1）。
激光显微镜是通过改进的LSM 410（
脉冲持续时间最初是在MINI（APE，柏
ZEISS，Jena，德国）用40x / 1.3油浸物镜实
林，德国）自动相机的激光出口处用中心发射
现的。激光扫描时间t = 16s的显微镜扫描方式
波长为88fs，在800nm处为80fs，在850nm处为
512×512用于细胞照射。这些细胞在同一焦点
91fs来确定的，假定了高斯函数。一般来说，
平面上被扫描了10次。这些实验是在800nm的
由于发散光束的存在，被测物体焦平面的测量
图2：激光导致的破坏率（致死率）。
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[2] =>
LASER TRIBUNE
20 激光论坛
并通过酶促反应转化成强绿色荧光钙黄绿素，
它不能通过完整的膜。乙炔-同型二聚体-D1是
一种红色荧光，即所谓的死细胞染色剂，它只
能穿透受损的细胞膜，并通过与DNA结合而
显著增强。在辐照后，生命/死亡试剂盒被孵
育5.5小时。用双光子激发来实现荧光。
激光诱导的ROS形成的验证
ROS的形成是根据Hockberger等的方法
3a
3b
通过双光子激发确认的原位膜的透水荧光团
3c
dihydroflurescein（DHF）。首先，将细胞与
标记物（10μM，Fluka，Germany）一起温
育，并在15分钟后对其辐照。只有一种ROI（
感兴趣的区域）受到辐射。周围的细胞被用
作对照。照射后，以4mW的低功率实现全帧
扫描，以便观察效果。
结果
对脉冲展宽单元进行调整，使每个激光
波长的焦点的脉冲持续时间为700 fs±50 fs。
3d
3e
3f
将单个DPSC细胞扫描10倍，并测定其与未
图3a-f：激光诱导的ROS形成的验证。
被证明是困难的。采用了一个非线性测量二极
辐照的周围细胞的效果。另外，使用CHO细
生命/死亡的测试
下温育20分钟。
胞完成比较实验。为了尽可能地抑制细胞间
管，因此便于在高光圈物镜的焦平面上进行
为了检验牙髓干细胞的活力，应用分子
活细胞被钙黄绿素（绿色光谱的发射）
通讯，选择了广泛分布的细胞或细胞簇。在
测量。自相关函数（ACF）可以用Gauss-，
探针（Eugene, Oregon, USA）进行了测试。
染色，死细胞被乙炔-同型二聚体-D1染色，在
扫描过程中，检测到传输信号，并将其作为
Lorentz-或Secanthyperbolicus-based分析程序
将 2μM钙 黄 绿 素 AM和 4μM乙 二 胺 二 聚 体 -
红色光谱（细胞核）中排放。钙黄绿素AM是
图像显示在监视器上。共有325个细胞进行
来计算脉冲持续时间。
D1的混合物加入到细胞室中，并在37℃温度
一种非荧光染料，易于渗透活细胞的细胞膜，
形态学检查和生命/死亡试验，50个细胞接受
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[3] =>
LASER TRIBUNE
激光论坛 21
表1：DPSC细胞黑点发生
表2：CHO细胞黑点发生
mW
总受辐照细胞
有黑点的细胞
mW
总受辐照细胞
有黑点的细胞
16
10
0
16
10
0
18
10
0
18
10
0
20
69
1
20
69
0
26
72
21
26
72
11
ROS检查。将结果与先前的脉冲宽度为170
fs的结果进行了比较。
形态改变
所谓的黑点是由特定的照射功率参数在
细胞中明显的肉芽形成的位置产生的。激光功
率逐渐增加2mW，以测量出现第一次激光诱
导形态变化的阈值（表1）。在这些条件和最
佳聚焦条件下，DPSC细胞出现黑点的最小功
率为20 mW，CHO细胞为22 mW（表2）。在
26mW的功率下，30％的DPSC细胞和仅15％
的CHO细胞表现出这些形态变化。激光诱导
的黑点细胞通常在接下来的5小时内出现形态
学变化，从而显示出光损伤效应。
生命/死亡测试
首 先 ， 用 不 同 的 功 率 参 数 （ 4mW，
12 mW， 1 6mW， 20m W和 3 2mW） 照 射
DPSC细胞。将辐照细胞标记，在5.5小时后用
生命-/死亡试剂盒孵育，孵育1小时后测试其
荧光行为。在20mW的照射下，69个DPSC细
胞中的64个显示出绿色的细胞质荧光，而在
5个DPSC细胞中观察到红色荧光（表3）。这
相当于7％的伤害。当功率提高到26mW时，
已经有35％受到致命的影响。然而，所有的
CHO细胞都耐受20mW的功率，其中15％在
功率为36mW时染色（表4和图2）。与较短
脉冲宽度的实验相比较，其中已经有73％的
DPSC细胞在20mW的功率下被损坏，这表明
细胞更耐受较长的700fs的脉冲宽度。
验证激光诱导形成的ROS（活性氧）
辐照显示，在平均功率低于35mW的情
况下，没有检测到DHF信号。从图3 （a和b的
上部）可以看出，在上部辐照的细胞中，在
37mW的较高功率下检测到ROS信号。在较
低的未照射的细胞中也发生弱的荧光信号。
然而，该细胞通过膜接触与辐照细胞连接。
如果功率只是微不足道地增加，其影响就会变
得更加明显。在图3c中，被照射的细胞显示出
明显更高的强度。这种效应也与辐照细胞的大
量荧光相结合（图3f）。 因此，在700fs的脉
冲持续时间的照射期间形成破坏性的氧自由
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LASER TRIBUNE
22 激光论坛
表3：DPSC细胞的死亡情况
表4：CHO细胞的死亡情况
mW
总受辐照细胞数
活细胞
死亡细胞
死亡%
mW
总受辐照细胞数
活细胞
死亡细胞
死亡%
16
10
0
0
0
16
10
0
0
0
18
10
0
0
0
18
10
0
0
0
20
69
64
5
7
20
69
68
0
0
26
72
47
25
35
26
72
67
11
14,5
基。与170fs实验相比，平均功率明显较高是
实现可检测的ROS形成所必需的。
结论
DPSC在被描述的辐照条件下，其脉冲宽
度为700fs，比170fs的脉冲宽度短，对辐照的
敏感性较低。平均功率参数为20mW，在辐
照后6小时内，高达10%的细胞会受到致命的
影响。平均功率为26mW时，仍有三分之二
的细胞存活。在较短的脉冲宽度下，所有细
胞都将受到致命的影响。
在更高的脉冲宽度和恒定的脉冲能量下
观察到的较低的灵敏度与在780nm的照射波
长下对中国仓鼠卵巢细胞（CHO）的早期研
究的结果一致。在这些早期的研究中，得出
的结论是损伤是受双光子效应影响的，因此
可以根据公式来预测损伤效应E。
E~P²/t with P：平均激光功率和t:脉冲宽度
与此相比，由于F=700fs / 170 fs=4的脉冲
宽度增加，因此，为了达到同样的破坏性效
果，需要增加因子S=1.7到2的功率。
这个关系不能完全根据所提供的数据来
确定，但可以假定S> 1.25的因子，因为已经有
7％的DPSC细胞死亡，平均功率为16mW，脉
冲持续时间为170fs，但在700fs时需要20mW
来达到同样的效果。
DPSC细胞在700fs的脉冲宽度比CHO细胞
更敏感。在26mW激光功率的暴露下，与35％的
DPSC细胞相比，只有15％的CHO细胞受损。检
测到的ROS形成表明了光化学损伤过程。LT
LT
作者信息
Prof. Dr Karsten König
Saarland University
Campus A5.1, Room 2.35
66123 Saarbrücken，德国
Tel.: +49 681 3023451
k.koenig@blt.uni-saarland.de
Dr Anton Kasenbacher
Obere Hammerstr. 5
83278 Traunstein，德国
Tel.: +49 861 4692
a.k@ts-net.de
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