Labo Tribune France No. 1, 2020

Adhésion de nanoparticules d’hydroxyapatite (HA) aux matériaux dentaires dans l’environnement buccal

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Adhésion de nanoparticules d’hydroxyapatite (HA) aux matériaux dentaires dans l’environnement buccal
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LABO TRIBUNE
The World’s Laboratory Newspaper · Édition Française

AOÛT/SEPTEMBRE 2020 | VOL. 12, NO. 8+9

www.dental-tribune.fr

Adhésion de nanoparticules d’hydroxyapatite (HA)
aux matériaux dentaires dans l’environnement
buccal
Cintia Mirela Guimarães Nobre, Norbert Pütz et Matthias Hannig
Clinique de dentisterie opératoire, parodontologie et dentisterie préventive, hôpital universitaire de la Sarre, 66421 Homburg, Allemagne

Les nanoparticules d’hydroxyapatite (nano-HAP) suscitent une énorme attention dans le domaine des applications dentaires et leur
adhésion à l’émail est bien établie. Il n’existe cependant aucun rapport concernant le comportement des HAP en présence d’autres
matériaux dentaires, et la plupart des études menées dans ce domaine reposent sur des modèles in vitro qui ne tiennent pas compte
des interactions entre l’apatite et la pellicule d’origine salivaire. Cette étude pilote in situ visait par conséquent à évaluer les effets de
trois solutions à base d’hydroxyapatite et leurs interactions avec diverses surfaces de matériaux dentaires dans l’environnement buccal. À cet effet, deux volontaires ont porté des gouttières intra-orales sur lesquelles avaient été ﬁxés des échantillons d’émail et de trois
autres matériaux dentaires : titane, céramique et polyméthacrylate de méthyle (PMMA). Trois solutions aqueuses ont été préparées
avec différentes formes et tailles de nano-HAP (HAP I, HAP II, HAP III) à une concentration de 5 %. Après une attente de trois minutes
pour permettre la formation de la pellicule sur les matériaux, les volontaires ont utilisé 10 mL de solution pour rincer leur bouche
durant 30 secondes. Un rinçage à l’eau a servi de contrôle. Les échantillons ont été vériﬁés immédiatement après l’utilisation de la
solution de rinçage, puis 30 minutes et deux heures plus tard. Des examens au microscope électronique à balayage (MEB) et au microscope électronique en transmission (MET) ont été réalisés pour caractériser les particules, et la MEB a permis d’évaluer les interactions entre les HAP et la pellicule. Les résultats MEB et MET ont montré de fortes variations dans la plage des tailles particulaires
utilisées. Après deux heures, une couche hétérogène de HAP était présente sur les surfaces d’émail, de titane, de céramique et de
PMMA en contact avec le milieu buccal. Des structures en forme de pont étaient visibles entre les nano-HAP et la pellicule formée sur
les surfaces d’émail, de titane et de PMMA. En conclusion, les nano-HAP peuvent adhérer non seulement à l’émail, mais également
aux surfaces dentaires artiﬁcielles dans l’environnement buccal. L’étude a démontré que la pellicule acquise agit comme un pont
entre les nano-HAP et la surface des matériaux.
Introduction
L’application de nanoparticules d’hydroxyapatite (nano-HAP) en dentisterie
a suscité une énorme attention au cours
des dernières années.1–4 L’hydroxyapatite
(Ca10(PO4)6(OH)2) est une céramique phosphocalcique et représente le principal composant minéral de l’émail dentaire, le tissu
dur qui forme la couche externe d’une dent
humaine. Sa structure est celle d’une cristallite caractérisée par une morphologie aciculaire et représentant plus de 90 % de la composition minérale de l’émail.5–7 Les nanoHAP synthétiques sont considérées comme
morphologiquement et structurellement
similaires aux cristaux d’apatite de l’émail
et sont donc dotées d’une excellente
biocompatibilité.1, 5, 6 Selon une analyse de la
documentation effectuée récemment par
M. Epple, les HAP, qui sont un matériau non
toxique et non immunogène, ne présentent
aucun effet indésirable pour la santé humaine lorsqu’elles sont appliquées à des
doses appropriées.8 D’autres caractéristiques qui en font un matériau biomimétique attrayant sont notamment sa haute
énergie de surface, son excellente solubilité
et sa bioactivité optimale.6, 8, 9 Les nano-HAP
trouvent donc de plus en plus leur place
dans diverses applications dentaires. Par
exemple, en dentisterie restauratrice et préventive, il est possible d’utiliser les HAP
pour reminéraliser les premières lésions carieuses de l’émail et par conséquent de protéger les dents contre la carie et l’érosion
dentaire.7, 10–13 En raison de ses propriétés,
l’hydroxyapatite est ajoutée à la composition de dentifrices et de solutions de rinçage
pour la compléter, non seulement comme
matériau de réparation de l’émail lésé, mais

aussi comme agent de polissage, d’éclaircissement dentaire et de désensibilisation.5, 7, 14–16
Les données de la littérature prouvent en
outre que la taille et la forme des particules
d’hydroxyapatite jouent un rôle important
qui inﬂue sur leurs propriétés et les applications.17 On trouve sur le marché plusieurs
sortes de HAP synthétiques sous forme de
poudres brutes, mais selon les dernières publications, les poudres qui contiennent des
particules de petite dimension obtiennent
de meilleurs effets reminéralisants.15, 16, 18, 19
Bien que la plus grande partie de la littérature corrobore les propriétés prometteuses
des nanoparticules d’hydroxyapatite, les résultats sont très divergents.7 Alors qu’un
nombre croissant d’essais révèlent la capacité des nano-HAP à réparer l’émail,1, 2, 19–21
d’autres études n’indiquent aucune différence entre les effets reminéralisants obtenus avec un traitement par nano-HAP et un
traitement ﬂuoré standard, et certaines des
études annoncent même des résultats
moins efﬁcaces.3, 11, 22 Ces conclusions très variables pourraient être liées à la méthodologie mise en œuvre. La plupart des études sur
l’utilisation des nanoparticules d’hydroxyapatite dans les produits de soins buccodentaires sont des modèles in vitro dont les
résultats sont limités. Cette méthodologie
ne reproduit pas les conditions intraorales
réelles en raison de divers facteurs de nature individuelle, tels que le ﬂux salivaire, la
nutrition, ou les bactéries présentes dans la
cavité orale.23
De plus, presque tous les résultats in vitro
concernent l’interaction directe entre les
HAP et la surface de l’émail.1, 2, 4, 17 Dans l’environnement buccal cependant, une couche
protéique appelée « pellicule exogène ac-

quise » se forme immédiatement sur toute
surface exposée à l’environnement intraoral. La pellicule exogène acquise est déﬁnie
comme un ﬁlm acellulaire exempt de bactéries, composé de nombreuses molécules
salivaires, notamment des protéines, glycoprotéines, mucines, immunoglobulines,
lipides, composants bactériens et autres
macromolécules.23–25 La pellicule agit comme
une barrière protectrice, présente une fonction lubriﬁante, et modiﬁe également l’énergie libre et les charges de la surface des matériaux.25 La nature de l’interaction entre la
pellicule et l’apatite est donc la première
étape à franchir pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent les effets supposés
des nano-HAP dans l’environnement buccal. Un modèle d’étude in situ est la méthode la mieux indiquée pour évaluer cette
interaction puisqu’un tel modèle reproduit
les conditions orales réelles et mène ainsi à
un résultat plus ﬁable.
Très peu d’études in situ ont été menées
sur l’utilisation des particules d’hydroxyapatite sous forme de produit buccal, mais
toutes montrent systématiquement que les
HAP augmentent les effets protecteurs de la
pellicule contre l’érosion26 et qu’il est donc
possible de les utiliser comme agent reminéralisant.27–29 De récentes publications
d’études in situ indiquent également que les
solutions de rinçage à base de nano-HAP
peuvent réduire l’adhésion initiale des bactéries sur l’émail sans les tuer. Ce phénomène est causé par un effet anti-adhésion
qui contrarie la formation du bioﬁlm sur les
surfaces amélaires et peut donc agir à la manière d’un agent biomimétique régulateur
du bioﬁlm.9, 30 Des études supplémentaires
in situ/in vivo sont cependant nécessaires

pour clariﬁer les interactions entre les HAP
et la pellicule, ainsi que le mécanisme d’action de l’hydroxyapatite.
Étant donné que la formation de la pellicule n’est pas limitée à l’émail, une autre
question utile porte sur l’adhésion éventuelle des HAP à d’autres matériaux dentaires, ce qui élargirait leurs utilisations
avantageuses aux surfaces dentaires artiﬁcielles couramment employées pour les restaurations buccales. Cette étude pilote in
situ visait donc à évaluer la possibilité d’une
adhésion des nano-HAP sur différentes surfaces de matériaux dentaires dans l’environnement buccal, et à évaluer les effets de
trois poudres de HAP différentes. Nous
avons également examiné s’il existait des
différences entre les interactions HAPpellicule sur l’émail et d’autres substrats
dentaires, tels que le titane, le polyméthacrylate de méthyle et la céramique.

Matériel et méthodes
Cette étude pilote in situ a été menée
chez deux volontaires sains âgés de 30 à 35
ans. Les critères d’inclusion étaient une
bonne santé bucco-dentaire sans signes de
gingivite, de caries ou de débit salivaire
non physiologique ;31 aucune affection systémique ; pas de prise d’antibiotiques ou
d’un traitement parodontal, quel qu’il soit,
au cours des 6 derniers mois ; nonfumeur ; ni grossesse ni allaitement en
cours ; et pas de port d’appareils orthodontiques. Le protocole d’étude a été approuvé par le comité d’éthique médicale
de l’Association médicale de la Sarre, Allemagne (no 283/03-2016), et un consentement éclairé écrit a été obtenu chez les sujets.

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RECHERCHE

Entreprise

Pays

Taille moyenne (%) Configuration

HAP I

Eprui

Chine

40 nm

Aciculaire

HAP II

Kalichem

Italie

100 nm

Aciculaire

HAP III

Sigma Aldrich

Allemagne

< 200 nm

Sphérique

Labo Tribune Édition Française | Août/Septembre 2020

Tableau 1 : Spéciﬁcation des poudres de particules d’hydroxyapatite selon les indications du fabricant.

1 – Solutions analysées
Des nanoparticules d’hydroxyapatite
(nano-HAP) de différentes tailles ont été utilisées pour la solution d’essai (Tableau 1). La
taille des particules a été vériﬁée par microscopie électronique à balayage (MEB) et
microscopie électronique en transmission
(MET). La solution d’essai à base de HAP a été
préparée par mélange de 0,5 g dans 10 mL
d’eau bidistillée. La solution de rinçage à
l’eau (10 mL) a servi de contrôle négatif. Les
sujets ont utilisé les diverses solutions de
rinçage à des semaines différentes pour éviter des interférences entre les solutions d’essai et de contrôle, et prévenir ainsi la survenue d’un effet croisé. Selon notre protocole,
la première solution utilisée par chaque volontaire était le contrôle aqueux. Une semaine plus tard, les solutions d’essai à base
de HAP ont été introduites dans l’ordre suivant : HAP I, HAP II et HAP III ; tout en respectant également une fenêtre thérapeutique de deux semaines entre chacune
d’elles.

Zahnfabrik, Allemagne). Ces plaques ont été
poncées à l’aide de papier abrasif (grains de
240 à 4 000). Pour assurer le nettoyage et la
désinfection, les échantillons en céramique
ont été immergés dans de l’isopropanol
(70 %) pendant quinze minutes, puis lavés à
l’eau distillée.
d. Échantillons de PMMA :
Une résine de polyméthacrylate de méthyle
(PMMA), d’un diamètre de 5 mm et d’une
épaisseur de 1 mm, a été préparée au moyen
d’un kit de résine autopolymérisante
(poudre et monomère) Paladent (Kulzer,
Allemagne), selon les indications du fabricant, et d’une technique prothétique utilisée à l’université de la Sarre. La résine a été
poncée au moyen de papier abrasif (grain
de 1 200 à 4 000) et nettoyée selon le protocole décrit ci-dessous. Les échantillons ont
subi trois traitements par ultrasons (chaque
fois dix minutes), deux fois dans de l’isopropanol à 70 % et une fois dans de l’eau stérile.
Enﬁn, les échantillons ont été séchés avant
de les ﬁxer aux gouttières.

2 – Échantillons
Outre l’émail dentaire, d’autres matériaux couramment utilisés dans les dispositifs de restauration bucco-dentaire ont
été évalués : le titane (le matériau le plus
courant dans les implants dentaires),
les céramiques feldspathiques (utilisées
comme matériau de restauration dentaire), et la résine de polyméthacrylate de
méthyle (matériau courant dans la base
des prothèses).

3 – Exposition buccale
Pour évaluer l’interaction éventuelle
entre les particules d’hydroxyapatite et la
pellicule exogène acquise, les échantillons
ont été montés dans des gouttières maxillaires individualisées (Fig. 1). Ils ont été préparés à partir de feuilles de méthacrylate
d’une épaisseur de 1,5 mm, couvrant la zone
des prémolaires à la première molaire. Des
perforations dans les faces vestibulaires des
gouttières ont été réalisées, pour ﬁxer le
matériau à empreinte en polysiloxane de
vinyle dans lequel chaque matériau avait
été introduit. Avant l’utilisation des gouttières, les volontaires ont brossé leurs dents
sans dentifrice et les ont simplement rincées à l’eau courante, aﬁn d’éviter de possibles interférences avec les composants
d’un dentifrice. Après l’insertion intra-orale
des gouttières munies de trois échantillons
sur chaque côté (total de six échantillons
du matériau sélectionné), un rinçage
unique (30 secondes) avec 10 mL de la solution choisie (HAP I, HAP II, HAP III, ou eau) a
été effectué après un temps d’attente de
trois minutes, pour permettre à la pellicule
de se former. Un échantillon a été prélevé
sur chaque côté, immédiatement après
l’utilisation de la solution de rinçage, puis
30 minutes et 120 minutes plus tard. Après
chaque prélèvement, les échantillons ont
été rincés à l’eau distillée, pour éliminer les
particules non adsorbées. Ensuite, les
échantillons ont été préparés pour l’examen au microscope électronique à balayage (MEB). Chaque volontaire a porté la
gouttière durant deux heures, entre dix et
douze heures. L’utilisation de la gouttière
portant les six échantillons a été répétée
pour chacun des quatre matériaux et chacune des quatre solutions analysées, ce qui
a mené à un total de 96 échantillons par volontaire.

a. Échantillons d’émail :
Des plaquettes carrées d’émail ayant environ 5 mm de long et 1 mm d’épaisseur ont
été préparées à partir d’incisives bovines.
Ensuite, elles ont subi un ponçage standard
au moyen de papier abrasif (grains de 240 à
2 500 pour MEB et MET), et la boue dentinaire a été éliminée selon la technique de
nettoyage normalisée décrite ci-dessous.30
Les échantillons ont d’abord été lavés à l’hypochlorite de sodium (NaOCl) à 3 % pendant
trois minutes, puis passés aux ultrasons
dans de l’eau distillée durant cinq minutes.
Ensuite, ils ont été désinfectés dans de
l’éthanol à 70 % pendant quinze minutes. Et
enﬁn, les échantillons ont été lavés à l’eau
stérile et conservés à 4 °C dans de l’eau stérile pendant 24 heures.
b. Échantillons de titane :
Des disques en titane (Ti) présentant une
surface microstructurée par sablage et mordançage à l’acide (SLA) et une rugosité
moyenne de surface (Ra) de 2 μm, de grade 2,
ont été fournis par Dentsply Implant Systems (Dentsply Sirona, Mannheim, Allemagne ), diamètre de 5 mm, hauteur de
1 mm. Les disques en Ti ont été polis par un
ponçage humide à l’aide de papier abrasif
(grains de 800 à 4 000). Pour éliminer la
boue dentinaire résultante et assurer une
désinfection, les disques en Ti ont été immergés dans de l’isopropanol (70 %) pendant dix minutes, puis lavés à l’eau distillée.
c. Échantillons de céramique :
Des plaquettes carrées/rectangulaires en céramique, d’une longueur de 5 mm et d’une
épaisseur de 1 mm environ, ont été préparées à partir de blocs de céramique feldspathique (VITABLOCS Mark II de VITA

4 – Microscopie électronique à balayage
Aﬁn de caractériser la taille et la forme
des particules des différentes poudres, les
solutions de HAP I, HAP II et HAP III ont
été directement appliquées sur le porteéchantillon MEB (une plaque d’aluminium)
et analysées par MEB et spectroscopie à
rayons X à dispersion d’énergie (EDS), au
moyen du microscope XL30 ESEM FEG (FEI,

Fig. 1 : Gouttière intra-orale maxillaire pourvue de plaques d’émail.

Eindhoven, Pays-Bas), sous un grossissement de 20 000 fois et à une tension d’accélération de 5 kV et 10 kV. Les échantillons exposés à l’environnement buccal ont été préparés pour l’analyse MEB, aﬁn d’examiner
l’étendue de la pellicule à différents moments suivant l’utilisation de la solution de
rinçage, ainsi que ses liens avec les particules d’hydroxyapatite. Après l’exposition
buccale, les échantillons ont été lavés à l’eau
stérile, puis ﬁxés au glutaraldéhyde à 2 %
(1 mL dans un tampon de cacodylate 0,1 M)
durant deux heures à 4 °C. Enﬁn, les spécimens ont été séchés à l’air pendant la nuit, à
température ambiante dans la chambre à
circulation d’air. Le lendemain, les échantillons ont été revêtus de carbone par pulvérisation cathodique et analysés par MEB et
spectroscopie à rayons X à dispersion
d’énergie (EDS), au moyen d’un microscope
XL30 ESEM FEG (FEI, Eindhoven, Pays-Bas),
successivement à une tension d’accélération de 5 kV puis de 10 kV, sous un grossissement atteignant 20 000 fois.
5 – Microscope électronique en transmission
Pour évaluer la taille des particules, des
solutions de nano-HAP à 5 % ont été préparées à partir de chaque poudre. Celles-ci ont
été appliquées directement sur des grilles
en cuivre revêtues de Pioloform et analysées avec le microscope MET Tecnai 12
Biotwin (FEI, Eindhoven, Pays-Bas) sous un
grossissement atteignant 100 000 fois. Un
autre essai a également été effectué pour
conﬁrmer la présence de la pellicule. Les volontaires ont porté les mêmes gouttières
munies de deux échantillons d’émail seulement (un sur chaque côté), puis effectué un
rinçage unique durant 30 secondes avec
10 mL de solution de HAP II, après avoir attendu trois minutes pour permettre à la pellicule de se former. Les échantillons ont été
retirés de la cavité orale 30 minutes après
l’utilisation de la solution de rinçage. Immédiatement après le retrait des gouttières de
la bouche, les échantillons ont été lavés à
l’eau stérile pour éliminer les bactéries qui y
étaient présentes. Les spécimens ont été
placés dans des tubes de 1,5 mL contenant
1 mL d’une solution de ﬁxation à base de
glutaraldéhyde à 1 % et maintenus à 4 °C durant une heure. Après cette première ﬁxation, les échantillons ont été lavés quatre
fois avec un tampon de cacodylate 0,1 M,
chaque fois dix minutes, et conservés à 4 °C
dans le tampon de cacodylate. Les échantillons ont ensuite été ﬁxés dans du tétroxyde
d’osmium durant une heure, dans une
chambre sombre à température ambiante,
puis lavés cinq fois pendant dix minutes à

l’eau distillée et immergés dans de l’éthanol
à 30 % pendant une nuit. Après la préparation pour l’analyse MET, ils ont été déshydratés à température ambiante, dans des
bains successifs d’éthanol à 50 % (2 x 10 min),
70 % (2 x 20 min), 90 % (2 x 30 min) et 100 %
(2 x 30 min). Pour terminer, ils ont été plongés dans deux bains d’acétone à 100 %,
chaque fois 30 minutes, et maintenus toute
une nuit dans un mélange d’acétone/Araldite (Agar Scientiﬁc, Stansted, RoyaumeUni) contenant 3 % d’un accélérateur (mélange A), à température ambiante. Le lendemain, le mélange A a été éliminé et un second mélange (mélange B) a été préparé
(mélange d’Araldite avec 2 % d’accélérateur).
Les échantillons ont été laissés de nouveau
toute une nuit dans le mélange B, dans la
chambre à circulation d’air à température
ambiante. Ensuite, un nouveau mélange B a
été utilisé pour remplir les récipients servant à l’inclusion des échantillons et le tout
a été mis à polymériser pendant 48 h dans
une étuve à 65 °C.
Des coupes ultraﬁnes ont ﬁnalement été
réalisées au moyen d’un ultramicrotome
équipé d’un couteau diamant (Leica EM
UC7, Allemagne) et placées sur des grilles de
cuivre revêtues de Pioloform. Elles ont été
colorées avec des solutions aqueuses d’acétate d’uranyle et de citrate de plomb, à température ambiante. Après un lavage intensif
à l’eau distillée, les bioﬁlms pouvaient être
analysés au microscope MET Tecnai 12 Bio
Twin (FEI, Eindhoven, Pays-Bas) sous un
grossissement atteignant 100 000 fois.

Résultats et discussion
Cette étude pilote a, pour la première fois,
prouvé qu’il est possible d’accumuler des
nano-HAP sous forme de cristallite et de
sphères sur la surface de l’émail naturel,
mais aussi sur diverses surfaces dentaires
artiﬁcielles présentes dans l’environnement
buccal, et la pellicule peut jouer un rôle important dans le mécanisme d’adhésion des
particules.
1 – Échantillons d’émail
Cette étude a utilisé de l’émail d’origine
bovine. Au cours des dernières décennies,
diverses raisons ont en effet mis un frein à
l’utilisation de dents humaines pour la recherche, notamment la complexité de la
normalisation, la difﬁculté d’obtenir des
quantités sufﬁsantes et surtout la question
éthique.32, 33 Le recours aux dents d’animaux
est donc apparu comme une alternative.
L’émail bovin présente des similitudes avec
l’émail humain au regard de la composition
minérale, de la densité et de la structure. Il

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est également facile de se procurer les dents
bovines en grande quantité et leurs caractéristiques sont uniformes. De plus, leur taille
plus grande et leur surface plus plate facilitent leur manipulation.4, 32, 34
2 – Particules d’hydroxyapatite
Les études déjà publiées démontrent que
la taille et la forme des particules et des
agrégats inﬂuencent les propriétés des HAP
et leurs applications. La taille des particules
est en outre un facteur clé pour l’adhésion
sur l’émail.4, 15, 16, 18 Dans une étude in vitro, Li
et al. ont suggéré qu’un diamètre de 20 nm
des cristallites de HAP était la meilleure dimension pour les applications nano-HAP.17
Partant de l’hypothèse que les nanoparticules plus petites (HAP I) devraient produire
de meilleurs résultats quant à l’adhésion, la
présente étude a évalué trois poudres d’hydroxyapatite contenant des particules dont
la taille moyenne était à l’échelle du nanomètre. La taille des particules de chaque
poudre d’hydroxyapatite a été analysée par
MEB et MET. HAP I et HAP II se situaient
dans une petite fourchette de tailles et présentaient une certaine uniformité dimensionnelle des particules. Les particules HAP I
variaient de 30 nm à 70 nm (Fig. 2) et les particules HAP II de 60 à 120 nm (Fig. 3). HAP III
présentaient les écarts de taille les plus importants, allant de particules de 50 nm à
des particules même plus grosses que 1 μm
(Fig. 4). Ces variations dimensionnelles des
particules de chaque poudre d’hydroxyapatite utilisée dans cette étude montraient
une certaine similitude. Par conséquent, il
n’a pas été possible d’évaluer en détail l’inﬂuence de la taille des particules d’apatite
sur leur comportement d’adhésion dans
l’environnement buccal. Nos résultats indiquent que de meilleures méthodes de
synthèse des HAP doivent être mises en
œuvre pour standardiser la taille des particules.
En ce qui concerne les caractéristiques
morphologiques des HAP, nos analyses MEB
et MET ont conﬁrmé les structures de type
cristallite des HAP I et HAP II (Figs. 2 et 3). La
ﬁgure 4 présente une majorité de HAP III
sphériques, mais sur l’image MET, on observe
également des structures non globulaires.
Les HAP III sont donc principalement composées de particules sphériques et de
quelques particules aciculaires. Chose étonnante, dans cette étude, les particules sphériques ont adhéré sur chaque surface de
la même façon que les particules aciculaires.
Les essais in vitro ont révélé que les cristallites de HAP ont une meilleure adhésion à
l’émail, car leur morphologie est similaire
aux unités élémentaires de l’émail naturel.4, 17
Mais une autre étude in vitro a montré que
les nano-HAP sphériques étaient dotées d’un
excellent potentiel de reminéralisation de
l’émail.1 À notre connaissance, ceci est la première étude in situ étude qui compare les effets des nano-HAP sphériques avec ceux des
nano-HAP de type cristallite, et elle a montré
que les deux formes peuvent adhérer à la
pellicule formée in situ sur différents matériaux dentaires.
De plus, indépendamment de leurs tailles
et formes, les trois hydroxyapatites analysées avaient tendance à s’agglomérer en solution aqueuse (Figs. 2–4) pour former des
agrégats de tailles différentes et de formes
irrégulières. Des particules isolées ont été
observées plus fréquemment dans la solution de HAP III et présentaient clairement
une forme sphérique. Les HAP I et II n’ont
que rarement permis d’observer des cristallites individuelles en solution aqueuse. Cette
tendance à former des agrégats pourrait être
liée à la structure dipolaire de la molécule

Fig. 2 : Image MEB sous un grossissement de 20 000 fois (a), image MET sous un grossissement de 68 000 fois et (b), analyse EDS sous un grossissement de
5 000 fois (c) de la poudre de HAP I au contact d’une solution aqueuse. Les images montrent la forme cristallite et la tendance à la formation d’agrégats.

Fig. 3 : Image MEB sous un grossissement de 20 000 fois (a), image MET sous un grossissement de 68 000 fois (b), et analyse EDS sous un grossissement de
5 000 fois (c) de la poudre de HAP II au contact d’une solution aqueuse. Les images montrent la forme cristallite et la tendance à la formation d’agrégats.

d’hydroxyapatite et par conséquent aux
forces électrostatiques et de Van der Waals
entre les particules.30 Un autre résultat commun à toutes les solutions analysées a été la
diminution avec le temps de la quantité de
particules d’hydroxyapatite et de la taille des
agrégats sur chacune des surfaces des matériaux (Figs. 5–8). Ce modèle peut être expli-

qué par le processus d’adsorption et de désorption qui se déroule en permanence dans
la cavité orale.25 Après le rinçage avec les solutions de HAP, les particules et les agrégats
sont déposés sur la surface des matériaux.
Avec le temps, ces particules se dissolvent
dans la salive. De ce fait, les forces de cisaillement intra-orales contribuent à une déstabi-

lisation des particules qui mène à la formation de petits agrégats et de particules individuelles, dont une partie est réadsorbée
dans la pellicule ou déglutie. La dissolution
continue des nanoparticules d’hydroxyapatite qui se produit également, intensiﬁe ces
résultats. Les agrégats plus importants sont
aussi davantage exposés aux forces de cisail-

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Fig. 4 : Image MEB sous un grossissement de 20 000 fois (a), image MET sous un grossissement de 68 000 fois (b), et analyse EDS sous un grossissement de
5 000 fois (c) de la poudre de HAP III au contact d’une solution aqueuse. Les particules individuelles peuvent être facilement discernées.

lement, à l’élimination de la surface des matériaux et à une déglutition subséquente.4, 16
3 – Efﬁcacité d’adhésion de l’hydroxyapatite
Les micrographies MEB des échantillons
rincés à l’eau (contrôle) (Figs. 5–8) ont révélé
une couche mince et inégale, présentant des
structures globulaires sur toutes les surfaces après trois minutes d’exposition intraorale. Une analyse MET des échantillons sélectionnés a été réalisée pour vériﬁer la présence d’une pellicule à la surface des spécimens. L’image MET (Fig. 9) conﬁrme la présence de la pellicule exogène acquise sur les
spécimens. Après 30 minutes, la pellicule
avait continué de s’étendre sur les quatre
matériaux analysés et une surface d’aspect
presque totalement noueux s’était formée
après deux heures, composée d’agrégats de
protéines salivaires de forme globulaire. La
formation de la pellicule exogène acquise
lors de l’essai de contrôle a évolué en accord
avec les données de la littérature selon lesquelles l’adsorption des protéines et la for-

mation subséquente de la pellicule salivaire
commencent quelques secondes après l’exposition d’un matériau à l’environnement
buccal.25
Les interactions protéines-protéines
continuent et une pellicule protéique plus
épaisse et plus homogène est visible après
30 et 120 minutes. La quantité de protéines
absorbées a donc augmenté avec le temps
dans tous les échantillons analysés. Selon la
littérature, le développement de la pellicule
exogène acquise atteint un plateau après
30 à 90 minutes et sa pleine épaisseur une
heure ou deux après.25
Lors de l’application des solutions de
nano-HAP à 5 %, la distribution des nanoparticules s’était déroulée aléatoirement
sur toutes les surfaces des échantillons
(Figs. 5–8). Immédiatement après l’utilisation de la solution de rinçage, la plupart des
échantillons présentaient une surface hétérogène, recouverte avec des particules et des
agrégats dont la taille et la forme variaient
considérablement. HAP I et HAP II ont pro-

Fig. 5 : Micrographies MEB de la pellicule sous un grossissement de 5 000 fois et les nano-HAP sur les
échantillons d’émail. La formation de la pellicule et les particules d’hydroxyapatite sont visibles à trois
moments d’évaluation différents : immédiatement après l’utilisation de la solution de rinçage à base
de HAP I, HAP II et HAP III à 5 %, puis 30 minutes et deux heures après. Les ﬂèches blanches indiquent
les HAP accumulées sur la surface de l’émail.

duit de grands agrégats mesurant jusqu’à
4 μm. La couche de HAP III montrait une
meilleure répartition sur toutes les surfaces
des matériaux immédiatement après l’utilisation de la solution de rinçage. Trente minutes après le rinçage, le nombre de particules ﬁxées avait diminué et on pouvait observer un plus grand nombre de particules
dispersées sur l’image MEB ; toutefois, des
agrégats de plus petite taille étaient également visibles. Étonnamment, presque
toutes les nanoparticules ont été éliminées
des échantillons de titane rincés avec la solution de HAP I. Finalement, deux heures
après l’utilisation de la solution de rinçage,
des particules de plus petite taille étaient visibles sur les images MEB (Figs. 5–8) et on
pouvait encore observer de petits agrégats.
Par contre, des particules et des agrégats
d’une taille supérieure à 1 μm étaient rarement présents. La quantité et la taille des
agrégats d’hydroxyapatite sur chaque surface des matériaux a diminué avec le temps.
Jin et al. ont également rapporté l’inﬂuence

de la taille des HAP dans le cadre d’un essai
in vitro ayant démontré que les particules
de la taille du nanomètre (< 1 μm) adhéraient mieux à l’émail.16 L’étude in situ de
Kensche et al. n’a aussi montré que des
microagrégats isolés deux heures après
l’utilisation d’une solution de rinçage.30 En
raison de la surface de contact plus importante, des particules et des agrégats de plus
petite taille devraient donc mieux adhérer
aux composants de la pellicule. En résumé,
après deux heures d’exposition intra-orale,
tous les échantillons présentaient une
couche hétérogène et parsemée de nanoHAP en contact avec la pellicule externe. Un
recouvrement homogène n’a pas pu être
obtenu, probablement en raison des interactions complexes qui se produisent dans
l’environnement intra-oral, ou en raison de
la forme et de la taille des particules sélectionnées. Jusqu’à présent, les rares données
in situ sur ce sujet mentionnent seulement
l’adhésion entre les HAP et la surface de
l’émail.9, 30 D’après nos résultats cependant,
on peut conclure que les nanoparticules
d’hydroxyapatite adhèrent également à
d’autres surfaces dentaires, telles que le
titane, la céramique et le polyméthacrylate
de méthyle, ce qui ouvre la voie à un domaine de recherche prometteur en dentisterie préventive. Cette étude comportait
toutefois certaines limitations. La stabilité
de ces interactions impliquées dans l’adhésion des particules d’apatite sur les différentes surfaces analysées n’a pas été évaluée
sur de longues périodes. Une autre limitation évidente était le nombre de volontaires
qui n’a pas permis de réaliser une analyse
quantitative. Les raisons sous-tendant le
choix du peu de participants sont liées au
grand nombre d’utilisations de la gouttière
par chaque volontaire. Il est par conséquent
nécessaire de réaliser davantage d’essais in
vivo/in situ avec un nombre plus élevé de
sujets pour clariﬁer les mécanismes moléculaires fondamentaux des interactions
entre la pellicule et l’apatite.
Les caractér istiques physiques et
chimiques de chaque matériau inﬂuencent
la formation de la pellicule et du bioﬁlm, et
pourraient également inﬂuer sur le dépôt
des HAP.35 Les comparaisons entre tous les
matériaux ont montré que l’accumulation
des HAP sur les échantillons de céramique
était la plus faible après deux heures (Fig. 7),
tandis que les échantillons de PMMA contenaient le plus grand nombre de particules et
d’agrégats au bout du même temps (Fig. 8).
La porosité et les zones de rétention du
PMMA expliquent son association à un dépôt plus important de HAP.36, 37 Au regard des
solutions de HAP utilisées, les HAP II et III se
sont montrées plus efﬁcaces pour recouvrir

Fig. 6 : Micrographies MEB de la pellicule sous un grossissement de 5 000 fois et les nano-HAP sur les
échantillons de titane. La formation de la pellicule et les particules d’hydroxyapatite sont visibles
à trois moments d’évaluation différents : immédiatement après l’utilisation de la solution de rinçage
à base de HAP I, HAP II, et HAP III à 5 %, puis 30 minutes et deux heures après. Les ﬂèches blanches indiquent les HAP accumulées sur la surface de titane.

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Labo Tribune Édition Française | Août/Septembre 2020

RECHERCHE

Fig. 7 : Micrographies MEB de la pellicule sous un grossissement de 5 000 fois et les nano-HAP sur les
échantillons de céramique. La formation de la pellicule et les particules d’hydroxyapatite sont visibles
à trois moments d’évaluation différents : immédiatement après l’utilisation de la solution de rinçage
à base de HAP I, HAP II et HAP III à 5 %, puis 30 minutes et deux heures après. Les ﬂèches blanches indiquent les HAP accumulées sur la surface de céramique. Les HAP III tendent à s’accumuler sur les irrégularités de surface après deux heures (astérisques blancs).

Fig. 9 : Micrographie MET à un grossissement
de 30 000 fois montrant la présence de la pellicule formée après 30 minutes sur l’échantillon
d’émail rincé avec une solution de HAP II. La
pellicule apparaît comme une couche continue
et dense aux électrons. L’émail a été dissous en
raison de la déminéralisation des spécimens et
n’est donc plus visible sur l’image MET.

les échantillons de titane alors que les particules d’hydroxyapatite de HAP I étaient
presque absentes. Sur les surfaces d’émail et
de PMMA, on a observé un recouvrement similaire par les trois solutions. La ﬁgure 7
montre que les particules de HAP III se sont
aussi accumulées sur les irrégularités de
surface de la céramique, ceci en raison du

processus de polissage. Indépendamment
des variations morphologiques (sphères ou
cristallites) et dimensionnelles, les trois
types de nanoparticules de HAP analysés
pouvaient donc adhérer à l’émail, au titane,
à la céramique et au PMMA recouverts par
la pellicule.
Un grossissement MEB plus fort a été utilisé pour analyser les interactions entre les
nano-HAP accumulées et la pellicule qui recouvrait chaque substrat. Fait intéressant,
lorsque les solutions d’hydroxyapatite ont
été appliquées, on a pu observer les structures de connexion entre les particules et la
pellicule formée sur les surfaces d’émail, de
titane et de PMMA deux heures après l’exposition buccale aux solutions de rinçage
respectives (Fig. 10). Par contre, au bout de
deux heures, il n’a pas été possible de trouver ces structures sur la céramique en raison de la quantité réduite de HAP sur cette
surface. Selon Vukosavljevic et al., les précurseurs protéiques de la pellicule, tels que
les histatines ou les stathérines, possèdent
une afﬁnité élevée pour les cristaux d’hydroxyapatite présents sur les dents naturelles et amorcent le processus de formation de la pellicule exogène acquise.38 L’ad-

Fig. 8 : Micrographies MEB de la pellicule sous un grossissement de 5 000 fois et les nano-HAP sur les
échantillons de PMMA. La formation de la pellicule et les particules d’hydroxyapatite sont visibles à
trois moments d’évaluation différents : immédiatement après l’utilisation de la solution de rinçage à
base de HAP I, HAP II et HAP III à 5 %, puis 30 minutes et deux heures après. Les ﬂèches blanches indiquent les HAP accumulées sur la surface de PMMA.

hésion des nano-HAP synthétiques pourrait
donc être associée à ces composants de la
pellicule qui agissent comme un agent de
liaison. Davantage d’études in vivo/in situ
doivent être menées pour clariﬁer ces relations de façon détaillée.

Conclusions
Ainsi, pour la première fois, une étude a
démontré que toutes les nano-HAP appliquées sous forme de solutions de rinçage
orales, indépendamment de la forme et de
la taille, recouvrent efﬁcacement, mais de
façon hétérogène, les surfaces de l’émail, du
titane, de la céramique et du PMMA dans
l’environnement buccal. Les nano-HAP
peuvent donc adhérer non seulement à
l’émail, mais également aux surfaces dentaires artiﬁcielles dans des conditions intraorales. L’étude pilote a démontré la formation d’un pont entre les nano-HAP et les surfaces des matériaux en présence de la pellicule exogène acquise.
Étant donné l’importance croissante des
nanoparticules de HAP en dentisterie, il
est primordial de comprendre le mécanisme d’interaction de ces particules avec
l’environnement intra-oral. En dépit des
résultats intéressants obtenus dans cette
étude pilote, ses limitations imposent de
procéder à davantage d’essais sur un plus
grand nombre de sujets aﬁn de mieux clariﬁer les interactions entre la pellicule et
l’apatite.

Disponibilité des données
Toutes les données importantes à l’appui des
résultats sont présentées dans ce document.

Conﬂit d’intérêts
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conﬂit
d’intérêts au regard de la publication de cet
article.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Belinda
König, qui a préparé les échantillons pour
l’analyse MET et la Fondation allemande
pour la recherche (DFG, SFB 1027) pour son
soutien partiel à cette étude.

Fig. 10 : Micrographies sous un grossissement de 20 000 fois montrant la présence de la pellicule sur
les échantillons de titane (a) et d’émail (c) servant de contrôle par rapport au titane rincé avec HAP II
(b) et à l’émail rincé avec HAP III (d). Deux heures après l’exposition buccale à ces solutions, les images
prises sous plus fort grossissement permettent d’observer les structures de connexion entre la solution
de HAP II et la surface en titane (b) et entre la solution de HAP III et la surface de l’émail (d). Les HAP
sont en contact direct avec des structures globulaires de la pellicule exogène acquise. Les ﬂèches indiquent les ponts connectant les HAP entre elles, ainsi que les ponts entre les HAP et la pellicule.

Copyright © 2020 Cintia Mirela Guimarães
Nobre et al. Cet article en libre accès est mis
à disposition selon les termes de la licence
Creative Commons Attribution, qui en autorise l’utilisation, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que
l’œuvre originale soit dûment citée.
Source Wiley Hindawi, titre d’origine : Adhesion of Hydroxyapatite Nanoparticles to
Dental Materials under Oral Conditions
https://doi.org/10.1155/2020/6065739

Reçu le 31 mai 2019 ; Révisé le 21 février
2020 ; Accepté le 22 avril 2020 ; Publié le
5 mai 2020.

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Adhésion de nanoparticules d’hydroxyapatite (HA) aux matériaux dentaires dans l’environnement buccal
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Adhésion de nanoparticules d’hydroxyapatite (HA) aux matériaux dentaires dans l’environnement buccal

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